如何完成KEGG pathway分析并绘制气泡图？

前面，在《如何完成GO富集分析并绘制柱状图？》一文介绍了如何复现文章^[1]中的GO富集分析结果。做完了GO富集分析，接下来就是KEGG富集分析了！为了完全复现文章中的KEGG富集分析结果，这里和原文一样（下图A），使用Metascape进行在线分析。

当然，如果觉得下面的内容比较难的话，我这里推荐大家直接使用OmicShare 的KEGG富集分析工具，只需上传目的基因列表即可轻松完成KEGG富集分析和图表绘制，更多详细的教程可参考《GO、KEGG富集分析如何显示上下调基因？》一文。

闲言少叙，下面就仍以《如何完成GO富集分析并绘制柱状图？》一文中所使用的84个“oxidative stress”功能相关的差异基因进行KEGG富集分析。

首先，进入Metascape主页，将84个基因直接复制粘贴到gene list输入框中（Step1），然后点击Submit按钮上传基因列表。

工具链接：

www.metascape.org

Metascape支持的Gene ID类型主要有Symbol、RefSeq、Ensembl、UniPro和UCSC 共5种类型，比如我这里的就是基因Symbol号。

接着，在Step2中选择所对应的物种，这里选择人（H.sapiens），然后点击Custom Analysis按钮进行自定义分析。

在弹出的页面中，直接选择第4个选项（Enrichment）页面，仅勾选KEGG Pathway，取消勾选其他的数据来源，如下，并勾选跳过蛋白互作分析。

然后，点击Enrichment Analysis蓝色按钮进行富集分析，需要一点点时间。

完成分析后，可快速预览富集分析结果。然后，点击Analysis Report Page按钮，进入分析报告页面。

在分析报告页面中，点击Gene List Report Excel Sheets按钮，下载分析结果表格。

下载的分析结果表格如下，用于作图的数据主要在Sheet2表格中。

完成KEGG富集分析之后，接下来我们使用ggplot2包对分析结果进行可视化！

1. 读入数据

#载入相关的R包；
library(readxl)
library(ggplot2)
library(tidyr)
library(dplyr)
#读入Excel数据；
dt <- read_excel("metascape_result.t0bcfo25h.xlsx",sheet = 2)
#预览数据；
head(dt)

#提取用于作图的列；
df <- dt[,c(3,4,5,7)]
#对InTerm_InList列进行拆分；
df <- separate(df, InTerm_InList, sep = "/", into = c("Count", "InTerm"))
#转换数据类型；
df$Count <- as.numeric(df$Count)
#根据Pvalue选择Top10的pathway进行绘制；
fig_data <- df %>% top_n(-10,LogP) %>% arrange(Count)
fig_data

#转成因子，防止重新排序；
fig_data$Description <- factor(fig_data$Description,
levels=fig_data$Description,ordered=TRUE)
#预览数据；
fig_data

2. 绘制柱状图

#建立数据与图形（点）的映射关系，即确定点的(x,y)坐标，绘制散点图；
p1<-ggplot(fig_data, aes(Count,Description))+
geom_point(aes(size=Count,color=LogP))
#隐藏坐标轴的标题；
p2<-p1+labs(y="")
p2

#自定义颜色渐变；
p3<-p2+scale_colour_gradient(low="red",high="yellow")
p3

#设置x轴范围，避免点的溢出绘图区；
p4<-p3+scale_x_continuous(limits = c(5.5, 12.5),
breaks = c(6,8, 10, 12),
label = c("6","8", "10", "12"))
p4

3. 自定义主题

#应用自带主题；
p4+theme_light()

#自定义图表主题，对图表做精细调整；
top.mar=0.2
right.mar=0.2
bottom.mar=0.2
left.mar=0.2
#隐藏坐标轴，并对字体样式、颜色、刻度长度等进行限定；
mytheme<-theme_light()+
theme(axis.text=element_text(family = "sans",colour ="gray20",size = 10),
panel.grid = element_blank(),
axis.ticks = element_line(linewidth = 0.6,colour = "gray20"),
axis.ticks.length = unit(1.2,units = "mm"),
plot.margin=unit(x=c(top.mar,right.mar,bottom.mar,left.mar),
units="inches"))
p4+mytheme

好啦，本次的分享就到这里啦！

参考文献

[1]Shi W, Zhang X, Xu C, et al. Identification of Hub Genes and Pathways Associated with Oxidative Stress of Cartilage in Osteonecrosis of Femoral Head Using Bioinformatics Analysis[J]. Cartilage, 2022, 13(1): 19476035221074000.

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